Utvecklingen av nya diagnostiska metoder för cancer är av avgörande betydelse, med tanke på sjukdomens höga förekomst och dess position som en av de främsta dödsorsakerna i västvärlden. Denna masteruppsats presenterar utvecklingen av en riktad metod för enkelcellsanalys av mRNA med hjälp av droplet barcode sequencing (DBS), med särskild inriktning mot detektion av cirkulerande tumörceller (CTC) och analys av tumörheterogenitet. Metoden kombinerar oligonukleotid-funktionaliserade magnetiska kulor för mRNA-infångning, mikrofluidik för inkapsling av enstaka celler i droppar samt emulsion-PCR (emPCR) för amplifiering kopplad till unika streckkoder. Metoden utvärderades på två cancer-cellinjer, SW480 (kolorektal) och MCF7 (bröstcancer), där tio överuttryckta mRNA-transkript valdes för riktad analys. Experimentella resultat visade att majoriteten av dessa transkript kunde fångas in och amplifieras framgångsrikt. Den största utmaningen identifierades dock i kopplingen mellan dropparnas droplet barcodes och cDNA amplikon, vilkevisade sig vara en begränsande faktor. Omfattande felsökning genomfördes, redigering av kopplingsprimer design och amplifieringsoligonukleotider, utvärdering av template-switching-oligonukleotider samt alternativa polymeraser, liksom olika strategier för att motverka kulaggregering som observerades under projektets gång. Slutligen kunde två gener (LDHB och MLPH) kopplas framgångsrikt, vilket bekräftar metodens genomförbarhet. Med fortsatt optimering har detta tillvägagångssätt potential att utvecklas till en skalbar och kostnadseffektiv plattform för CTC-detektion, analys av tumörheterogenitet och framtida precisionsdiagnostik inom cancervården.

The development of novel cancer diagnostic methods is of critical importance given the disease’s high prevalence and its status as one of the leading causes of mortality in the Western world. This thesis presents the development of a targeted single-cell mRNA analysis method utilizing droplet barcode sequencing (DBS), particularly in the context of circulating tumor cell (CTC) detection and tumor heterogeneity assessment. The method integrates oligonucleotide-functionalized magnetic beads for mRNA capture, droplet microfluidics for single-cell compartmentalization, and emulsion PCR (emPCR) for barcode-coupled amplification. The approach was evaluated using two cancer cell lines, SW480 (colorectal) and MCF7 (breast), with ten overexpressed mRNA transcripts selected for targeted capture. Experimental validation demonstrated successful capture of the majority of these transcripts and their subsequent amplification. However, the coupling of droplet barcodes with cDNA proved to be the primary bottleneck of the method. Extensive troubleshooting was undertaken, including the redesign of coupling primers and amplification oligonucleotides, evaluation of template-switching oligonucleotides and alternative polymerases, as well as various optimization strategies to address bead clumping observed throughout the project. Ultimately, two genes (LDHB, MLPH) were successfully coupled, establishing proof-of-concept. With further optimization, this approach has the potential to become a scalable and cost-efficient platform for CTC detection, tumor heterogeneity profiling, and precision diagnostics in cancer care.