Titinfragment som cirkulerar i blodet framträder som nya biomarkörer för Duchennes muskeldystrofi (DMD), men deras förekomst på nanogram per milliliter pressar konventionella immunoassays till detektionsgränsen. Denna avhandling integrerar Cavidis signalförstärkningsteknik Binding Oligo Ladder Detection (BOLD) med en LUMINEX baserad suspension bead array (SBA) för att skapa en ultrasensitiv sandwich-analys för titin fragment. I BOLD-SBA-arbetsflödet konjugeras detektionsantikroppar till en oligo-dT-primer som, efter bindning till bead-fångat antigen, fungerar som mall för polymerasdriven förlängning. Signalen förstärks genom att flera fluorescerande prober binder till den förlängda DNA- stegen. Konjugeringen av oligo-dT-primern optimerades först, där ett 20-faldigt molärt överskott av NHS-PEG₄-azid-länkare och oligo-dT-primer mot titin 2 antikroppen gav tydliga bandförskjutningen på antikroppens tunga kedja vid SDS-PAGE samtidigt som ospecifik bindning begränsades. I marsvinsserum med tillsatt titin 2 antigen ökade BOLD-SBA den specifika fluorescenssignalen 38- till 76-faldigt jämfört med den konventionella biotin- streptavidin-avläsningen. Den BOLD-amplifierade analysen visade ett linjärt dynamiskt område för detektion av antigennivåer från 1 till 5 ng/ml innan “Hook-effekten” uppträdde vid 7,5 ng/mL. Arbetet visar att BOLD-amplifiering kan överföra en standard SBA till attomolnivå av känslighet samtidigt som den bara kräver några mikroliterprov. Detta lägger gunden för framtida multiplexanalyser som kan kvantifiera flera olika biomarkörer samtidigt utan att kompromissa med den analytisk prestanda. När metoden utmanades med poolat humant DMD serum kunde BOLD-SBA fortfarande detektera titin 2 fragment, även om analysfönstret minskade ungefär 20-faldigt, vilket tyder på matrisnterferens som det återstående problemet.

Titin fragments circulating in blood are emerging treatment outcome biomarkers for Duchenne muscular dystrophy (DMD), but their nanogram-per-milliliter abundance pushes conventional immunoassays to the edge of detectability. This thesis integrates Cavidi’s Binding Oligo Ladder Detection (BOLD) signal-amplification technology with the LUMINEX suspension bead array (SBA) to create an ultrasensitive sandwich assay for titin fragments. In the BOLD-SBA workflow, detection antibodies are conjugated to an oligo-dT primer which, upon binding to bead-captured antigen, serves as a template for polymerase-driven extension. The signal is amplified by multiple fluorescent probes binding to the extended DNA ladder. Oligo-dT primer conjugation was first optimized, where a 20-fold molar excess of NHS-PEG₄-azide linker and oligo-dT primer against titin 2 antibody gave clear upward band shifts of the antibody’s heavy chain on SDS-PAGE while limiting non-specific binding. In guinea pig serum spiked with titin 2 antigen, the BOLD-SBA increased specific fluorescence signal 38- to 76-fold over the conventional biotin-streptavidin read-out. The BOLD amplified assay showed a linear dynamic range for detection of antigen level from 1 to 5 ng/mL before the “Hook effect” appeared at 7.5 ng/mL. The results demonstrate that BOLD amplification can decrease the quantification of a standard SBA to attomole-level sensitivity while consuming only a few microliters of sample. This establishes a foundation for future multiplex assays that will simultaneously quantify different biomarkers without compromising analytical performance. When challenged with pooled human DMD serum, BOLD-SBA still detected titin 2 fragments, although the analytical window narrowed roughly 20-fold, which suggested matrix interference as the remaining issue.