Genterapi är en metod för att behandla genetiska sjukdomar genom att introducera genetiskt material för att återupprätta felande genetiska funktioner eller hämma defekta gener. Rekombinant Adeno-associerat virus (rAAV) producerat I trippeltransfekterade HEK293-celler är den vanligaste vektorn för leverans av genetiskt material. För att minska priset på sådana terapier och göra dem mer tillgängliga är det avgörande att minska produktionskostnaderna. Ett sätt att göra det på är att förbättra utbytet vid produktion av rAAV. Virala hjälparprotein har visat sig vara nödvändiga och påverka produktionen av rAAV. Syftet med det här projektet är att kartlägga ett av dessa hjälparproteins interaktom, bestämma dess intracellulära lokalisering, samt undersöka dess effekt på produktionskinetik. I det här projektet utfördes en normal rAAV2-trippeltransfektering av HEK293F-celler, utökad med en fjärde plasmid med en gen för FLAG-märkt hjälparprotein. Genom immunoprecipitering med hjälp av magnetiska kulor samt MS/MS identifierades kandidater till hjälparproteinets interaktom från cellysat. Konfokalmikroskopi användes för att visa att hjälparproteinet primärt lokaliseras längs cellkärnans membran. Proteinuttryckskinetik utvärderades med semi-kvantitativ analys av Western blot-bilder för AAV Viralt protein 3 (VP3), AAV Replikationsprotein 52 (Rep52) och DNA-bindande protein (DBP) från Adenovirus. Med hjälp av flödescytometri, ELISA och qPCR analyserades uttrycket av hela rAAV kapsider och replikationen av viralt genom.

Gene therapy is a method for treating genetic diseases by introducing genetic material to restore missing genetic functions or suppress the activity of defective genes. Delivery of genetic material in vivo is most commonly performed using recombinant Adeno-associated virus vectors (rAAV) produced in triple transfected HEK293 cell lines. To reduce prices and improve accessibility of these therapies, it is crucial to reduce the manufacturing costs. One way of doing this is by improving the yield and titer of the rAAVs. Viral helper proteins have been determined to be essential and impact rAAV production. The purpose of this project is to map the interactome of one of these helper protein, determine its subcellular localization, and evaluate its effect on production kinetics when overexpressed. In this project, HEK293F cells were successfully transfected with standard rAAV2 triple transfection plasmids and an additional plasmid coding for FLAG-tagged helper proteins. Using magnetic bead pulldown assays and MS/MS, the helper protein interactome candidates were identified from lysates. Using confocal microscopy, cellular localization of the helper proteins was primarily observed in close vicinity of the nuclear membrane. Expression kinetics analysis of AAV Viral Protein 3 (VP3), AAV Replication protein 52 (Rep52) and adenoviral DNA binding protein (DBP) were also studied using semi-quantitative western blotting analysis. Flow cytometry, ELISA and qPCR was used to analyze expression of assembled rAAV capsids and viral genome replication.