Extracellulära vesiklar (EVs) är mycket heterogena och bär på RNA-molekyler som kan återspegla ursprungscellens tillstånd. De förekommer i alla typer av kroppsvätskor och innehåller vävnadsspecifika markörer, vilket möjliggör potentiell identifiering av tumörens ursprung i blod- eller plasmaprover. Kostnadseffektiva tekniker, såsom realtids-PCR (qPCR), kan användas för att detektera EV-RNA och erbjuder högre känslighet jämfört med konventionella metoder med låg specificitet. EV-mRNA utgör därmed lovande icke-invasiva biomarkörkandidater för tidig cancerdiagnostik via vätskebiopsier. Syftet med detta projekt var att utveckla och utvärdera ett arbetsflöde för högkapacitetsanalys av enskilda EV-transkriptom med Droplet Barcode Sequencing (DBS)-teknologi. Isolerade EVs kapslades in i emulsionsdroppar tillsammans med kulor (beads) med poly(T)-fragment, och en unik droplet barcode (DBC) introducerades i varje droppe. Efterföljande biblioteksberedning inkluderade emulsions-PCR (emPCR) och qPCR, och biblioteken utvärderades med TapeStation. Ett bibliotek sekvenserades även på en nanoporeplattform, och dataanalys genomfördes genom att köra ett analysflöde på Dardel vid PDC Center for High Performance Computing (PDC) via Simple Linux Utility for Resource Management (SLURM) med både test- och experimentella dataset. Arbetsflödet lyckades kapsla in enskilda kulor i droppar, även om mikrofluidiken var utmanande. Specifika strategier utvecklades därför för att hantera dessa problem. TapeStation-resultaten indikerade ett lovande bibliotek; däremot visade nanoporesekvenseringen avsaknad av transkriptderiverade sekvenser samt vissa handle-sekvenser. Istället observerades konkatemerer av en handle och DBC-sekvenser samt den omvända komplementära handle-sekvensen, troligen som ett resultat av misslyckad emPCR. Övriga steg i arbetsflödet, inklusive dataanalys, fungerade väl, och grafer över antalet unique molecular identifiers (UMIs) per DBC genererades från testdatasetet. Framtida arbete bör fokusera på att optimera emPCR-steget, utvärdera primerfunktionalitet samt att oberoende utföra PCR-amplifikation av DBCs i bulk för att säkerställa korrekt amplifikation. Hashingexperiment med humana och murina EVs bör även genomföras för att validera enskild EV-analys när arbetsflödet fungerar korrekt.

Extracellular vesicles (EVs) are highly heterogeneous and carry RNA molecules that may reflect the state of their cell of origin. Present in all types of body fluids, their cargo contains tissue-specific markers, allowing for potential identification of the tumor origin in blood or plasma samples. Cost-effective techniques such as real-time PCR (qPCR) can be used to detect EV RNA, increasing the sensitivity compared with conventional low-specificity methods. EV mRNA thus represents a promising non-invasive source of biomarkers for early cancer diagnostics via liquid biopsies. This project aimed to develop and evaluate a workflow for high-throughput analysis of single-EV transcriptomes using Droplet Barcode Sequencing (DBS) technology. Isolated EVs were encapsulated in emulsion droplets with beads coated with poly(T) fragments, and a unique droplet barcode (DBC) was introduced to each droplet. Sequential library preparation included emulsion PCR (emPCR) and qPCR, and libraries were evaluated using a TapeStation. One library was additionally sequenced on a nanopore platform, and data analysis was performed using a computational pipeline executed on Dardel at the PDC Center for High Performance Computing (PDC) via the Simple Linux Utility for Resource Management (SLURM) on both test and experimental datasets. The workflow successfully encapsulated single beads in droplets, though microfluidic operation was challenging. Specific strategies were thus developed to address related issues. TapeStation results suggested a promising library profile; however, nanopore sequencing revealed the absence of transcript-derived sequences and certain handles. Instead, concatemers of one handle and DBC sequences were observed, as well as the reverse complement of this handle, likely as a result of emPCR failure. Other workflow steps, including data analysis, performed well, with successfully generated plots showing unique molecular identifier (UMI) counts per DBC in the test dataset. Future work should now focus on optimizing the emPCR step, evaluating the primer functionality, and independently testing bulk PCR amplification of  DBCs to ensure correct amplification. Hashing experiments using human and murine EVs should also  be performed, provided that the workflow functions properly, to validate single-EV analysis.